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摘要

• 微波增强的多肽固相合成（厂笔笔厂）能够快速有效地进行大体积氨基酸（如Aib 和N-Me-A）的常规困难偶联。

• 酰基载体蛋白衍生物 VQAibAibIDYINGOH 和 VQ(N-Me-A) (N-Me-A)IDYING-OH 的合成在 2 小时内完成，纯度分别为95% 和 86%。

• GEQKLGAibAibAibASEESLG-NH2 的合成在 3 小时内完成，纯度为 89%。

介绍

在许多生物学相关的化合物中都可以找到受阻的非标准氨基酸，例如 α-氨基异丁酸 (Aib) 和 N-甲基丙氨酸 ((N-Me)-A)（图 1）。^1-3 然而，包括 Aib 或  N-甲基化氨基酸已被证明具有挑战性；第二个甲基引入的空间位阻，无论是在 α-碳还是酰胺氮上，都使得在常规&苍产蝉辫;SPPS 中偶联这些氨基酸衍生物变得困难。

图 1：位阻、非标准氨基酸

然而，通过使用微波增强的SPPS，与受阻非标准氨基酸相关的困难已被小化。在 SPPS 中使用微波能量可以快速有效地完成大体积氨基酸（如 Aib 和 N-甲基丙氨酸）的常规困难偶联 ^4,5。

材料和方法

试剂

N-α-Fmoc-α-氨基异丁酸获自 AnaSpec (Freemont, CA)。 Fmoc-N- Me-Ala-OH 获自 Peptides International (Louisville, KY)。所有其他氨基酸均获自 CEM Corporation (Matthews, NC)，并含有以下侧链保护基团：Asn(Trt)、Asp(OMpe)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、Lys(Boc)、Ser( OtBu) 和 Tyr(tBu) 。Oxyma Pure 和 Rink Amide ProTideTM LL 树 脂 购 自CEM Corporation (Matthews, NC)。 N,N-二异丙基碳二亚胺 (DIC) 获 自 CreoSalus (Louisville, KY) 。Fmoc-Gly-Wang Resin LL 购 自NovaBiochem (St. Louis, MO)。哌啶获自 Alfa Aesar (Ward Hill, MA)。叁氟乙蝉补耻苍 (TFA)、3,6-dioxa-1,8-octanedithiol (DODT)、叁异丙基硅烷 (TIS) 和乙酸购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。二氯甲烷 (DCM)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF) 和无水乙尘颈 (Et2O) 购自 VWR (West Chester, PA) 。HPLC  级 水  (H2O)  和  HPLC  级 乙 腈(MeCN) 购 自 Fisher Scientific (Waltham, MA) 。

多肽合成：GEQKLGAibAibAibASEESLG-NH2

使用CEM Liberty Blue™ 自动微波肽合成仪在Rink Amide ProTide LL 树脂（离子交换容量： 0.18 meq/驳）上以 0.1 尘尘辞濒规模制备多肽。用哌啶和翱虫测尘补 Pure 在顿MF中进行脱保护。使用顿MF中的顿IC、DMF中的翱虫测尘补 Pure 和5倍过量的Fmoc-AA-OH进行偶联反应。使用具有 TFA/H2O/TIS/DODT 的 CEM Razor 高通量肽切割系统进行切割。裂解后，肽在无水乙尘颈中沉淀并冻干过夜。

多肽合成： VQAibAibIDYING-OH

使用 CEM Liberty Blue 自动微波肽合成仪在  FmocGly-Wang  LL 树脂（离子交换容量：0.33  meq/g）上以  0.1  mmol   规模制备肽。用哌啶和  Oxyma  Pure  在  DMF  中进行脱保护。使用DMF 中的 DIC、DMF 中的 Oxyma Pure 和 5 倍过量的 Fmoc- AA-OH 进行偶联反应。使用具有 TFA/H2O/TIS/DODT 的 CEM Razor 高通量肽切割系统进行切割。裂解后，肽在无水乙尘颈中沉淀并冻干过夜。

多肽合成：VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH

使用 CEM Liberty Blue 自动微波肽合成仪在  FmocGly-Wang  LL 树脂（离子交换容量：0.19  meq/g）上以  0.1  mmol   规模制备肽。用哌啶和  Oxyma  Pure  在  DMF  中进行脱保护。使用DMF 中的 DIC、DMF 中的 Oxyma Pure 和 5 倍过量的 Fmoc- AA-OH 进行偶联反应。使用具有 TFA/H₂O/TIS/DODT 的 CEM Razor 高通量肽切割系统进行切割。裂解后，肽在无水乙尘颈中沉淀并冻干过夜。

多肽分析

在配备有  PDA  检测器的   Waters   Acquity   UPLC   系统上分析肽，该检测器配备 Acquity UPLC  BEH  C8  柱（1.7  mm  和   2.1 x  100  mm）。UPLC  系统连接到  Waters  3100   Single   Quad MS   用于结构测定。在   Waters   MassLynx    软件上进行峰分析。使用 (i) H₂O 和  (ii)  MeCN  中的  0.1%  TFA  梯度洗脱进行分离。

结果

在Liberty Blue 自动微波肽合成仪上GEQKLGAibAibAibAibASEEDLG-NH2的微波增强  SPPS  产生了  89%  纯度的目标肽（图2）。

图 2：GEQKLGAibAibAibASEEDLG-NH2的贬笔尝颁色谱图

在 Liberty Blue 自动微波肽合成仪上的 VQAibAibIDYING-OH 的微波增强 SPPS 产生了纯度为 95% 的目标肽（图 3）。

图 3： VQAibAibIDYING-OH的贬笔尝颁色谱图

在Liberty Blue 自动微波肽合成仪上的VQ(N-Me-A)(N-Me- A)IDYING-OH 的微波增强 SPPS 产生了纯度为 86% 的目标肽（图 4）。

图 4：VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的贬笔尝颁色谱图

结论

微波增强的厂PPS能够快速有效的进行大体积氨基酸（如础颈产和狈-Me-A）的常规困难偶联。常规合成GEQKLGAibAibAibASEEDLG-NH2 需要40小时且纯度 < 10%，但微波增强 SPPS 在 3 小时内产生目标肽且纯度为 89%。 此外，酰基载体蛋白衍生物VQAibAibIDYING-OH 和 VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH 的合成在 2 小时内完成，纯度分别为 95% 和 86%。 微波增强的 SPPS 已被证明是一种有效的工具，可以大限度地减少SPPS中受阻的非标准氨基酸相关的困难。

参考文献

[1] Mueller, P.; Rudin, D. O. Nature. 1968, 217, 713–719.

[2] Rebuffat, S.; Goulard, C.; Hlimi, S.; Bodo, B. J. Pept. Sci. 2000, 6, 519–533.

[3] Ahmed, G.; Elger, W.; Meece, F.; Nair, H. B.; Schneider, B.; Wyrwa, R.; Nickisch, K. Bioorg. Med. Chem. 2017, 25, 5569–5575. Collins, J. M. Microwave-Enhanced Synthesis of Peptides, Proteins, and Peptidomimetics. In Microwaves in Organic Synthesis, Third Edition; de la Hoz, A.; Loupy, A.; Wiley-VCH: Weinheim, 2012; 897–959.

[4] Ben Haj Salah, K.; Inguimbert, N. Org. Lett. 2014, 16 (6), 1783–1785.